生信软件学习-CellRanger的安装和使用
最近因为换了工作，真正的做了一名分析💻，但是因为时间紧任务重，所以一直都是用自己自学的R来支撑工作。但这终究不是个办法。所以除了工作内的分析单细胞和空转的内容外，我大概也有自己的计划📕：
- 第一就是学习安装和使用自己之前了解但没实际操作过的重要软件🔬
- 再学一门流程语言，之前的同事建议我学个python或者perl🏇
先说学习软件吧，首先是单细胞分析的cellranger，因为下游分析我基本上都用R可以解决，所以主要还是上游分析的cellranger的熟悉和使用。
安装可以参考官网的介绍, 软件也可以从官网下载。值得注意的是：
🅾️🅾️🅾️ 一定不要选择从网页上下载，那个是有问题的，说多的都是泪，一定要要从crul或者wget方式下载。
当下载好了以后，cd到下载目录下，用tar解压缩后，就已经安装好了（免安装版本？！！），然后记得要导入环境变量中，要不然以后使用只能用绝对路径了。像我就是用的centos7的集群，我就是在home下vi ~/.bashrc,然后手动修改的，然后source ~/.bashrc就搞定了。
cd /download file
tar -xzvf cellranger-6.0.1.tar.gz
# 添加环境变量，目录要换成解压后的文件目录！
export PATH=/opt/cellranger-6.0.1:$PATH
当解压并导入环境变量后，我们可以检查下是否安装成功。在终端输入
cellranger testrun --id=tiny
这样Cellranger会自己进行自检查，但是这个用时还蛮久的。总之最后会生成一个tiny.mri.tgz检查报告文件，自己也可以解压出来看看。不过我感觉直接在终端输入cellranger count,只要出来的结果不是command not found应该就是安装成功了。
分析数据
如果是一个建库样本，无论测多少次，都可以直接用cellranger count来做分析。但如果是不同的建库样本，想要放在一起分析就需要（疑问：谁会这样做）：
先用cellranger count分别定量，然后用cellranger aggr合并样本。
但是随后我发现，cellranger aggr，的功能，好像Seurat也可以实现啊，这里面就纠结了，到底是选用官方的cellranger aggr，还是选用分析常用的Seurat。甚至我还特意跑去了网上搜索了下。根据Seurat的团队所述，其并不推荐cellranger aggr，原因是该方法可能会丢失大量的数据[1]。但也有人认为这取决于实验之间的批次效应，以及预期结果，简而言之就是如果有很大的批次效应，可以尝试用cellranger aggr做做看[2]。
我肯定选择Seurat，额，毕竟这样才能愉快放在一起分析
Cellranger count分析数据
首先要现在相当多的数据：
- 1）基因组文件
- 2）测序数据
下载基因组文件
human GRCH38 （大小11G🍵，这个文件不仅有fa和gtf文件，而且star的指引文件都构建好了。而且10x公司针对自己的产品做了部分优化）[3]
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
mouse mm10 大于10G大小🍵
curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
下载测序文件
接下来，从 10X 官网上的一个公开数据集下载 FASTQ 文件。本示例使用来自人类外周血单核细胞 （PBMC） 的1000 个 细胞 数据集，这些数据集由淋巴细胞（T 细胞、B 细胞和 NK 杀伤）和单核细胞组成🎯🎯🎯。
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_fastqs.tar
tar -xvf pbmc_1k_v3_fastqs.tar
定量分析
我们需要用到cellranger count命令来进行定量分析，可以先看命令的帮助文档，帮助我们理解其参数的含义。
cellranger count --help
### output start
#嗯，自己看吧，我懒得写了
### output end
总之，我用的参数是
cellranger count --no-bam\ #不需要bam文件
--nosecondary\ # 不需要它分析聚类和细胞分群
--disable-ui\ # 不需要web展示
--id=run_count_1kpbmcs \ #分析名称
--fastqs=/pbmc_1k_v3_fastqs \ #fq文件目录
--sample=pbmc_1k_v3 \ #样本名称
--transcriptome=/refdata-gex-GRCh38-2020-A #刚刚下载的基因组文件
大家学废了吗，这是我们自己的参数，按照官方默认的参数，其实就需要后四个参数就行，其他都是我自己添加的
结果展示
一般这1000个细胞，可能4核16G能够在8个小时内结束，还是很快的，结果乱起八糟的，其中有用的是outs文件下面的文件：
drwxr-sr-x 2 4.0K Apr 12 21:50 filtered_feature_bc_matrix
-rw-r--r-- 1 8.6M Apr 12 21:50 filtered_feature_bc_matrix.h5
-rw-r--r-- 1 651 Apr 12 21:57 metrics_summary.csv
-rw-r--r-- 1 87M Apr 12 21:51 molecule_info.h5
drwxr-sr-x 2 4.0K Apr 12 21:47 raw_feature_bc_matrix
-rw-r--r-- 1 17M Apr 12 21:47 raw_feature_bc_matrix.h5
-rw-r--r-- 1 2.4M Apr 12 21:57 web_summary.html
明显的filtered_feature_bc_matrix文件下的是可以直接作为Seurat的输入文件路径的（就是这么方便！）。
好了、完结！讲真，成熟的、或者商业化软件真是方便的很，反观一些发了文章就不管的软件都长毛了，也不维护下，给旁人徒增烦恼~，不过也强求不得。